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Nature Methods | 伊成器课题组开发胞嘧啶碱基编辑器脱靶效应检测的新工具

日期: 2021-06-09

202168日,北大-清华生命科学联合中心、英超买球app手机版伊成器课题组在Nature Methods杂志发表了题为“Detect-seq reveals out-of-protospacer editing and target-strand editing by cytosine base editors”的封面文章。在本研究工作的主要贡献如下:

1.建立了一种无偏向性的脱靶检测技术

作者通过捕获胞嘧啶碱基编辑器CBE ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [1]产生的中间体(dU),并进行一系列标记和富集 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [2, 3],获得具有连续C-to-T突变的脱靶信号,并将其命名为Detect-seqdU-detection enabled by C to T transition during sequencing)技术,该技术的主要技术路线如图1所示。

- 1 Detect-seq 技术路线图

2.通过Detect-seq技术发现CBE工具导致的全基因组上的大量脱靶位点

研究人员在人胚肾细胞HEK293T和人乳腺癌细胞MCF-7转染BE4max ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [4],使用多种不同的sgRNA对基因组靶向位点进行C-to-T的编辑;同时对这些样本中进行了Detect-seq检测。通过Detect-seq检测发现,除RNF2位点外,其它靶向位点均可以产生几十至数百个Cas9依赖型的脱靶位点(图2)。

-2 在三种不同sgRNA样品中鉴定到的Cas依赖型的脱靶位点 其中蓝色圆圈代表脱靶位点(off-targets),红色方块代表靶向位点(on-target EMX1 n=48VEGFA_site_2 n=511 HEK293_site_4 n=245

3.发现了两种新型脱靶位点(out-of-protospacer edittarget-strand edit

有趣的是,研究人员基于Detect-seq技术还发现了两种新型的Cas依赖型的脱靶编辑:sgRNA结合区域外编辑(out-of-protospacer edit)及靶向链编辑(target-strand edit)(图3)。sgRNA结合区域外编辑即C-to-T的编辑发生在sgRNA结合区域外;而靶向链编辑则是C-to-T编辑发生在sgRNADNA结合链。根据Detect-seq的结果,上述两种编辑普遍存在于Cas9依赖型的脱靶位点附近。

- 3 sgRNA结合区域外编辑与靶向链编辑模式图

综上所述,Detect-seq技术为碱基编辑领域内提供了一种能够高灵敏、高特异、无偏好性地检测细胞内的CBE脱靶位点的方法。脱靶效应理解的加深,也将为阐明CBE的催化机制、优化改造更安全的CBE工具带来新的视角与可能。

北大-清华生命科学联合中心、英超买球app手机版伊成器教授为本文通讯作者;前沿交叉学科研究院雷芷芯博士,英超买球app手机版博士研究生孟浩巍、吕志聪为本文的共同第一作者;该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金以及生命科学联合中心的资助。凤凰工程北大基地和英超买球app手机版高性能计算平台为该研究提供了支撑。

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41592-021-01172-w

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参考文献

1.Komor, A.C., et al., Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016. 533(7603): p. 420-4.

2.Xia, B., et al., Bisulfite-free, base-resolution analysis of 5-formylcytosine at the genome scale. Nat Methods, 2015. 12(11): p. 1047-50.

3.Zhu, C., et al., Single-Cell 5-Formylcytosine Landscapes of Mammalian Early Embryos and ESCs at Single-Base Resolution. Cell Stem Cell, 2017. 20(5): p. 720-731 e5.

4.Thuronyi, B.W., et al., Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity. Nat Biotechnol, 2019. 37(9): p. 1070-1079.